荧光微球的制备方法根据分类依据不同，可以有多种分类方法，从制备过程有无化学反应发生来分的话可分为化学法和物理法两种，物理法是指载体和荧光物质在制备微球的过程中不发生化学反应，仅仅通过简单的物理作用将载体与微球相结合制备荧光微球，主要包括有吸附法（染色法）、包埋法[和自组装法三种；化学法制备荧光微球则包括接枝法和共聚法两种。
1. 吸附法
这种方法也称为染色法，主要是靠载体与荧光分子之间的分子间作用力结合形成荧光微球。一般是将非水溶性的荧光物质溶解在丙酮、乙醇等水溶性有机溶剂中，再将其与微球载体的水分散体系相混合，这时荧光物质即会析出并被吸附(主要是静电作用)到微球表面，合成简图如图1所示。
通过物吸附法将荧光物质直接吸附到于微球表面，具有制备方法比较简单、成熟等优点。但是，它也有几个难以克服的缺点：荧光分子有可能占据微球表面过多的活性位置，而使生物活性大分子难以结合到微球表面或导致生物活性大分子失活；此外，荧光分子暴露在微球外表，容易受到外界环境及介质的影响，使检测的准确性及重现性不佳。
2. 包埋法
包埋法的基本原理是将荧光材料均匀分散在介质中，利用聚合反应、微胶囊化方法或分子自组装方法制备出荧光微球。制备出的荧光微球几乎都具有明显的核／壳结构。这种方法可以制备各种荧光微球，且制备的荧光微球可以包含多个荧光物质，因此可以发射出多个荧光信号。合成简图如图2所示。
包埋法很好地解决了物理吸附所产生的缺点，它将荧光物质完全包埋在微内部，使其不会受到任何外部因素的影响，保障了微球荧光强度的稳定性。
3. 自组装法
自组装法主要利用无机或有机的胶体球作为成膜模板，通过在其表面的静电吸附，将无机或有机荧光纳米微粒以交替的方式与不同种类的聚电解质组装成膜。层层自组装技术是以无机或有机微球为核，通过在其表面组装荧光聚电解质或荧光纳米粒子来制备荧光微球，可控制微球壳厚度，以及壳的尺寸和形状。
4. 接枝法
接枝法也称球外悬挂法，它是将表面带有功能基或改性后表面生成了功能基的微球与有活性官能团的荧光分子进行反应，通过化学键连接。荧光物质是以“荧光点”状态结合在聚合物微球载体表面的，如图4所示。
5. 共聚法
共聚法是特指带有可聚合官能团的荧光物质与可聚合官能团的有机单体进行聚合，所制备的均一结构的荧光微球。主要通过悬浮聚合、乳液聚合以及分散聚合方法共聚制备，这样制得的荧光微球各方面性能较为稳定，荧光物质在微球中的分布基本上是均匀的，如图5所示。
共聚法是目前制备荧光强度分布均匀的荧光微球的最好且唯一的方法。
上述的几种方法都是单一的制备方法，但是在实际的制备荧光微球过程中，大多数情况下都是将诸多方法结合起来使用来制备。
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